血紅蛋白納米微囊的制備與表征
時(shí)間:2005-06-22
趙健 劉昌勝
（華東理工大學(xué) 教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海，200237）
摘要
介紹了W/O/W復(fù)乳液法制備血紅蛋白納米微囊，包封率在72%~88%；所制納米微囊的粒徑分布在要求的70~200nm的范圍內(nèi)，形態(tài)規(guī)則，大多呈球形；zeta電位表明這種納米微囊表面帶有一定的負(fù)電荷，這使粒子不易聚集，對(duì)粒子的穩(wěn)定性有利；另外XRD圖譜表明PCL對(duì)血紅蛋白的包埋是有效的。這將為血紅蛋白納米微囊作為人造紅細(xì)胞提供一種有效的制備手段。
人血液代用品系指人紅細(xì)胞代用品，尤其是以血紅蛋白為基質(zhì)的納米微囊血液代用品模擬天然紅細(xì)胞膜和紅細(xì)胞內(nèi)的生物環(huán)境，用仿生的原理將高分子材料作為殼材料，內(nèi)部包埋血紅蛋白，制備成為“人工紅細(xì)胞”，是目前研究最活躍、同時(shí)應(yīng)用領(lǐng)域最廣泛的一類血液代用品。在構(gòu)建體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)納米粒時(shí)較好的粒徑范圍為70~200 nm。納米微囊的形態(tài)、粒徑、粒徑分布、表面性質(zhì)、包封率等是影響其體內(nèi)分布與穩(wěn)定性的主要因素。本文將介紹血紅蛋白的可生物降解聚合物納米微囊的制備以及關(guān)于納米微囊的表征。
實(shí)驗(yàn)方法:
(1)制備 采用復(fù)乳液溶劑揮發(fā)法制備血紅蛋白的可生物降解聚合物納米微囊。首先將血紅蛋白溶解，配制成內(nèi)水相加入到5%的PCL的二氯甲烷溶液中，經(jīng)超聲或高速勻漿乳化成W/O的初乳液，然后順次加入到外水相和分散相中，得W/O/W復(fù)乳液，在常溫常壓下連續(xù)攪拌，使溶劑完全揮發(fā)，制得血紅蛋白納米微囊的混懸液。空白微囊制備過(guò)程除無(wú)血紅蛋白，其余同上。混懸液經(jīng)10 000 rpm離心1 hr，沉淀微囊、順次洗滌、凍干貯存?zhèn)溆谩?BR>（2）表征 包封率的測(cè)定，取混懸液經(jīng)10 000 rpm離心1 hr后的上清液，用分光光度計(jì)法測(cè)其中血紅蛋白含量W1，設(shè)總透料血紅蛋白的量為W，則包封率的表達(dá)式如下：包封率EE%= W1/W（%）；粒徑及其分布的測(cè)定，取血紅蛋白納米微囊的混懸液適量，加雙蒸水稀釋后，用激光粒度分析儀測(cè)定體積平均粒徑，多分散度；zeta 電位測(cè)定，取血紅蛋白納米微囊的混懸液適量，分散在 pH不同的緩沖溶液中，用zeta電位儀測(cè)定納米微囊的zeta 電位；掃描電鏡觀察，血紅蛋白納米微囊經(jīng)沉淀、洗滌、凍干后，固定于采樣臺(tái)上，在納米微囊表面噴金，然后置于掃描電子顯微鏡下觀察納米粒子的形態(tài)；X-射線衍射，采用Rigaku D/max2550 VB/PC。實(shí)驗(yàn)條件為：功率40 kV,100 mA，銅靶，3500 CPS。
數(shù)據(jù)結(jié)果：血紅蛋白納米微囊的粒徑及其分布如圖1所示。從粒徑分布圖上可以看出，只有一個(gè)粒徑分布峰，血紅蛋白微囊的粒徑分布在80~200 nm之間，且分布較窄，大部分粒徑集中在100~160 nm的范圍內(nèi)；SEM觀察結(jié)果表明，血紅蛋白納米微囊大多呈球形，表面圓整；Zeta電位測(cè)定結(jié)果表明血紅蛋白納米微囊在pH大于４時(shí)帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，這使納米粒之間由于同種電荷的相互排斥作用而不易聚集，從圖上可以看出，pH越大，zeta電位的絕對(duì)值越大，也表明越大，對(duì)納米混懸液的穩(wěn)定性越有利。而在體內(nèi)血液循環(huán)的過(guò)程中，微弱的pH變化將不會(huì)影響血紅蛋白納米微囊的穩(wěn)定性；血紅蛋白、血紅蛋白同空白微囊的物理混合物以及包埋血紅蛋白的毫微膠囊等3個(gè)樣品的XRD圖譜見(jiàn)圖4。血紅蛋白及其同空白微囊的物理混合物的XRD圖譜均呈現(xiàn)非晶態(tài)衍射的散漫的“暈環(huán)”，而在蛋白微囊的圖譜上這種非晶態(tài)的特征不再出現(xiàn)，取而代之的是21.44°、27.439°、31.760°、45.52°和56.56°等共12個(gè)特征峰，即有確定 d值的銳衍射峰，這是PCL具有一定結(jié)晶性的特征，表明毫微膠囊中的血紅蛋白被包覆于殼材料之中；經(jīng)測(cè)定包封率在72%~88%，說(shuō)明此方法對(duì)血紅蛋白的包埋效率較好。
主要論點(diǎn)和結(jié)論：本文對(duì)復(fù)乳液法制備血紅蛋白納米微囊進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，并對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)試，得如下結(jié)論：所制納米微囊的粒徑分布在要求的70~200 nm的范圍內(nèi)，形態(tài)規(guī)則，大多呈球形，zeta電位表明這種納米微囊表面帶有一定的負(fù)電荷，這使粒子不易聚集，對(duì)粒子的穩(wěn)定性有利。另外XRD圖譜表明PCL對(duì)血紅蛋白的包埋是有效的。這將為血紅蛋白納米微囊作為人造紅細(xì)胞提供一種有效的制備手段。
