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初代脾臟淋巴細胞對高分子-PHA 聚合物與摻合物之生物相容性評估

時間:2005-06-27

尤明村、呂昀、周秀慧
輔仁大學生命科學系（臺灣）

一、中文摘要

        環境中微生物合成之聚羥基酯類 (polyhydroxyalkanoates; PHA)聚合物具有”生物分解性”、生物兼容性”及”生物適用性”的特質而成為目前最熱門的塑料取代者。發展PHA 材料成為塑料取代物的同時，PHA 高分子材料可研發成為高價值的生醫材料以供生物工程和生物醫學的應用。本計劃的目的是藉由體外免疫初代細胞測試系統評估對PHA 聚合物材料對細胞是否具毒性以及是否影響免疫反應，來評估PHB 或PHBV 生物兼容性和應用安全性。實驗的方法是將不同濃度PHB 或PHBV 的懸浮液與脾臟制備的初代細胞作不同時段的共同培養。實驗結果顯示 PHBV 不會影響脾臟初代細胞對T 或B 淋巴球分裂原的增殖反應。而PHB 卻隨濃度增加會抑制Con A 對脾臟T 淋巴球的增殖作用。另外，PHB 會增加脾臟初代細胞對NO 的釋放，并且PHB 可抑制LPS 對脾臟初代細胞在IL-1α、IL-6 和TNF-α的產生。另外以PHB 或PHBV 制成之薄膜植入老鼠背部皮下的結果顯示，PHB 或PHBV 不具毒性，也不會造成植入區周邊皮膜和毛發的異常，此結果顯示PHB 具生物兼容性與醫用安全性。

二、簡介
       發展”生物分解性塑料材料” 是目前發展生物可分解性的原料時，這些原料多半為一種生物高分子材料，具生物分解性(biodegradable)、生物吸收性(bioabsorbable)、甚至具生物兼容性(biocompatible)。因而在研發為”生物分解性塑料材料”同時，利用生物高分子材料的特質可同時開發具有安全性的生醫材料作為生物工程和臨床醫學之用。生物吸收性高分子材料應用產品可運用在外科縫合線，組織修補材料及藥物釋放控制等方面，配合各種藥物，營養素及生長激素等，在疾病的預防/治療與生物科技之應用非常寬廣，因此非常值得投入研究與開發。
       微生物合成之聚羥基酯類(polyhydroxyalkanoates,PHA)為一種天然生物合成高分子材料，目前主要是以 Ralstonia eutropha (以前稱為Alcaligenes eutrophus)菌種在喜氧狀態下，以醣類酦酵所得到的聚酯。近年來以PHA 的高分子聚合材料可用于醫學材料的研發例如drug delivery system 中的發放器(Pouton and Akhtar 1996)，另應用有藥品、殺蟲劑、除草劑、肥料、拋棄式物品、外科縫合材料，骨骼取代品、骨板、血管置換物。這些材料搭配各種藥物制成營養素及生長激素，在疾病預防治療與生物科技之應用非常寬廣。近年來，以高分子材料配合生物醫學的研究和技術已在組織工程學(tissue engineering)上廣泛的被使用，而PHA 的研發成功將可以配合醫工的發展，這會是未來科技的趨勢。
        有關哺乳動物對植體生物兼容性的評估，主要是受體的免疫系統是否對植入物產生免疫排斥反應(Graft rejection) ，植體免疫系統排斥反應主要包括非專一性 (non-specific)和專一性(specific)兩種免疫反應。因PHB 在活體外可水解成D-(-)3-hydrobutyric acid 的單元體，而 D-(-)-3-hydroxybutyric acid 是ketogenesis 代謝中所得到的 keto body 產物，此產物普遍存在高等動物的身體中。近日研究數據顯示，一個100-200 單元體所組合的低分子量 P(3HB)高分子，普遍存在原核和真核細胞膜上，可作為ion channel 的基本組成(Rensch et al, 1988a ,1992)。另外，P(3HB) 的含量可在人類的血液中偵測到，也是人類代謝的分解產物之一(Rensch et al, 1992)。基于以上種種，因而推測PHB 是具有生物兼容性，可應用在各種植體、植片、膠片等生醫材料的制作(Reusch et al, 1992)而不應具有毒性。然而PHA 在活體的植入研究結果并不一致，首先根據活體外的方式評估 PHB 兼容性研究指出，以小鼠纖維母細胞或倉鼠卵巢細胞 (CHO-k1)與PHB 片混合培養，并不會改變二種細胞生長和小鼠纖維母細胞中葡萄糖消耗與乳酸的產生(Lafferty et al, 1988; Pouton et al, 1988)。但以PHB 和PHV 聚合物制成的導管植入豬的冠狀動脈之實驗結果顯示，PHBV 植入四周后會導致嚴重的發炎反應，周圍纖維細胞增生及血管壁增厚的現象(van der Giessen et al, 1996)。另外以PHB 或PHB/VA 植入小鼠實驗結果顯示，PHB 摻合Hydroxyvalerate 或Valerate 時可造成受體植入物的急性發炎反應(Gogolewski et al, 1993)，顯示PHB 及其聚合物在生物體的兼容性仍需進一步確認，尤其以PHA 混合其它聚合物作摻合時，生物兼容性一定要準確評估以確保PHA 的醫用安全性。

三、實驗
1. PHA 復合物、PHA 摻合物和植入物(Implant) 準備
        此實驗所需PHA 單元體與復合物將自美國 Sigma-Aldrich 公司并保存于desiccators 中。PHA 和PHBV 植入體約2×15 mm 盤狀或4×7 mm 之柱狀(size 將依實驗條件做修正)先用hexane 處理去除不純之雜質，再以真空抽干并置于70% 酒精中作滅菌處理。
2.脾臟組織的收集和細胞懸浮液之備制
        新鮮細胞懸浮液的備制根據Chou et al(1996)之方法。實驗小白鼠先以乙醚麻醉后，由心臟抽取約1ml 血液，新鮮的脾臟由老鼠體內取出，利用無菌的磨砂玻片將脾臟、胸腺和淋巴結制成單一細胞懸浮液，細胞液于試管中靜置5 分鐘，取上清液轉入新管并離心（1500rpm，5 分鐘，4℃），保留細胞pellet 再與cold lysing buffer 作用3 分鐘以溶解紅血球，爾后以培養液終止紅血球溶解作用并盡速離心，清洗細胞2 次，以EtBr / AO 染色并于螢光顯微鏡下計數細胞，最后將脾臟細胞液稀釋成5x106 cells/ml 待用。
3 . 實驗動物
        本研究所使用之脾臟初代細胞和活體實驗動物主要來自純系SPF（specific pathogen free）雄性BALB/c 小鼠，出生8-10 周，體重約20 克重，自國家實驗動物中心購得，動物抵達后會被安置于一間干凈安靜的房間內飼養，并有人工調控光照周期，日夜各12 小時。溫度（25℃）與濕度（60-70%）均適度監控中，食物和飲水會按時供給與更換。動物的操作會依照標準實驗動物操作法來執行。動物的管理與飼養參考 Guide for care and use of laboratory（ILAR，1996）規則辦法施行。
4. PHA 生醫材料植入實驗
        將實驗小鼠分成三組：控制組、手術控制組和實驗組。實驗組將依植入物（PHB 和PHBV）之來源與制作再細分成幾個小組，每組動物只數為10~12 只，手術時，動物以 70mg/kg Pento-barbital (Sigma , USA )。腹腔注射麻醉， PHB 的薄膜植入前以70%酒精浸泡2 小時，再以無菌PBS 浸潤之后才植入手術部位，植入的皮膚先剃除毛發并以6% chlorhexidine 消毒溶液清洗，植入后傷口用含有抗生素的不沾敷料覆蓋并以彈性繃帶固定，手術后10~14 天拆除敷料，每個時段每組動物犧牲5~6 只，取得免疫組織與PHB 植入組織做進一步免疫功能的測定。
5. 細胞增殖活性分析（Mitogen Proliferation Assay）
        自BALB/c 小鼠取得的新鮮脾臟及胸腺，各經玻片研磨后形成單一懸浮細胞液備用。備制實驗所需的PHB 懸浮液（0-100μg/ml）、分裂原Con A（0-6μg/ml）及LPS（0-10 μg/ml）濃度并分別與5x105 cells 脾臟免疫細胞作用共同培養48 小時（37℃、5%CO2）。細胞增殖的反應結果將以MTT 測定法測定（Gerler et al., 1986），實驗結果以%控制組細胞值表示。
6. 細胞激素含量之定量分析（Cytokine Quantitation）
        樣本中IL-1、IL-6 與TNF-α 的含量主要是利用R & D system 的Duoset ELISA Development Kit 作測定，實驗操作依kit 所提供的流程完成，如今簡述如下：培養盤上每孔加入100 ul 已稀釋的capture antibody，室溫下培養2 小時，以 washing buffer 洗去未貼附的抗體，加入300ul 的blocking buffer 并于室溫下培養2 小時，以washing buffer 洗去殘余的溶液，加入100ul 的細胞上清液或細胞激素標準品溶液，室溫培養1 小時后亦以washing buffer 去除細胞上清液或標準品溶液，再加入100ul 的biotinylated goat anti-mouse Ab，室溫培養2 小時，以washing buffer 洗去未貼附的抗體，再加入100ul 的streptavidin-HRP，室溫培養20 分鐘后去除多余的substrate，加入100ul 的substrate solution，室溫下避光培養15-20 分鐘，以2N H2SO4 停止反應，測定波長450nm 的吸光值。所得之吸光值對照標準曲線求細胞激素的相對濃度。
7. 腫瘤壞死因子定性之測定（TNF Bio-Assay）
        實驗進行前2-3 天，將L929 細胞株由25T 培養皿轉入 75T 培養皿中大量培養，待L929 細胞株于培養皿中形成單層細胞后才開始進行實驗。實驗進行的第一天，收集培養皿中log 生長期的細胞并離心（1500rpm，10 分鐘），將細胞稀釋成2.5x105/ml，取100μl/well 的細胞加入96 孔培養盤中，于37℃、5%CO2 培養箱中培養18-24 小時。第二天，確定培養盤中的細胞已形成單層細胞后，先加入10μl/well Actinomycin-D（60μg/ml）抑制L929 細胞的增殖作用，再分別將待測的細胞上清液或TNF 標準品（0-100U/ml）加入，繼續培養24 小時。第三天，以PBS 去除培養盤之上清液及未貼附的細胞，再加入50μl/well stain solution（20% formalin + 0.2% crystal violet）于室溫中作用20 分鐘，以自來水浸泡培養盤數次，去除多余的染液，風干。第四天，加入100μl/well PBS/Ethanol solution（1：1）溶解細胞，測定波長570nm 吸光值，所得之吸光值對照標準曲線求TNF 濃度。
8. 一氧化氮濃度分析（Nitric Oxide Assay）
        免疫細胞與PHB、PHBV 或分裂原培養后所得的上清液中內含細胞釋放的一氧化氮，由于NO 在空氣中極不穩定易轉變為Nitrite 與Nitrate，因此此法是測定樣本中nitrite 的含量來評估NO 之含量。Nitrite 的濃度主要是利用NaNO2 作出Nrtrite 的標準曲線，以取得溶液中的NO/Nitrite 相對濃度。首先2mM NaNO2 以PBS 等量稀釋成0-100μM，Griess A 及B 等量混合形成Griess reagent，操作前將100μl/well Griess reagent 與NaNO2 或上清液混合作用10 分鐘，測定波長550nm 的吸光值，所得的溶液吸光值對照標準曲線可決定Nitrite 的濃度（Stuehr ＆Nathan, 1989）。

四、結果與討論
        生物高分子材料制成的產品早已被廣泛的應用在生醫材料、醫藥品、化妝品、食品、化工原料及研究等用途上，并且有逐年增加的趨勢。高分子—PHA 是一種由微生物合成之天然高分子，在商業界早已普遍用在日常用品容器或器具之材質，在醫學界，部分PHA 材料已結合其它生醫材料，用在長期藥物的攜帶設計、藥品、外科縫合材料，骨骼取代品、骨板和血管置換物等。
        生物相關性（Biocompatibility）是評估植入物與受體互動的觀察，當受體的細胞群感受到植入體存在時，細胞生長曲線和模式會因此植入物的材質作條件式的調整，如果植入物的化學結構差異度較大者，會影響受體細胞的活性和正常功能的表現。來自新鮮組織的初代細胞不僅可真實反應活體細胞之生理作用，對接下來活體實驗得評估具連續性和整體性。本研究為了驗證細胞株實驗之真實性，將取自小鼠脾臟和胸腺組織制成單一懸浮細胞，分別與高分子—PHB 或PHBV 作培養。研究材料是以購自美國Sigma-Aldrich 的PHB 或PHBV 進行測試，研究結果顯示高分子—PHBV 對脾臟細胞不具毒性也不會影響增殖反應，并且PHBV 也不會影響T 淋巴球分裂原（Con A）和B 淋巴球分裂原（LPS）對脾臟初代細胞活化增殖的作用（圖一和圖二），但PHB 卻隨濃度增加會抑制Con A 對脾臟T 淋巴球的增殖作用（圖一和圖二）。
        淋巴球在抗原之存在下也會釋放NO，NO 是一種訊號分子，可作用在不同目標細胞中，調控許多細胞死亡與增生之訊號反應，而過高的NO 反而會抑制淋巴球之增殖作用，實驗結果顯示（圖三B），高分子—PHBV 不會處進促LPS 刺激脾臟B 淋巴球和巨噬細胞對NO 的產生。但PHB 和PHBV 卻會增加培養液中Con A 刺激脾臟T 淋巴球對NO 的產生（圖三）。另外，Con A 和LPS 可以引發脾臟細胞中T、B 淋巴球和吞噬細胞活化而增殖，進而刺激其產生細胞激素。研究細胞激素結果顯示（圖四），在LPS 刺激下，培養液中加入高分子 PHB 會顯著抑制脾臟初代細胞對IL-1β、IL-6 和TNF- α的產生（圖四）。我們也以生物活性測驗（Bioassay）對PHB 處理后細胞所產生之TNF 的活性（數據未顯示）作評估，結果顯示，高分子PHB 不僅可造成初代淋巴細胞對TNF 制作量的減少，也會影響TNF 毒殺L929 細胞的活性表現（圖五）。根據此研究的結果建議PHB 雖不會顯著影響分裂原活化之淋巴球的增生，但卻顯示 PHB 對T 淋巴細胞的活性會有影響。甚至可能造成細胞失去正常功能。
         為了增加實驗的準確度，加上PHB 在體內分解須長時間，因此我們須作更長期的觀察，我們委托淡江大學董崇民老師將PHB 聚合物和PHBV 摻合物制作成薄膜(0.9 x 0.7x 0.02 cm 大小)，以進行植入小鼠背部皮下實驗；經過六個月評估顯示PHB 和PHBV 的植入，并不會造成植入區域和鄰近組織的病變，初期3 個月在植入周圍有白血球聚集，但此現象為短期，隨著傷口愈合，白血球聚集現象也隨著消失，并且植入區域皮膜和毛發生長正常（圖六），此結果顯示PHB 和PHBV 生物兼容性頗高，因而未來決定進行整體活體植入評估試驗。

五、參考文獻
1.Chou, S.H., Kojic, L.D., Nordyke-Messingham, K. and Cunnick, J.E. (1996) Characterization of the effect of 2-deoxy-D-glucose (2-DG) on the immune system. Brain. Behav. Immun. 10, 399-416.
2. Gerlier, D. and Thomasset, N. (1986) Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. J. Immunol. Meth. 94: 57-63.
3. Gogolewski S, Jovanovic M, Perren SM et al., (1993) Tissue response and in vivo degradation of selected polyhydroxyacids: polylactides (PLA), poly(3-hydroxybutyrate)(PHB), and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHB/VA). J Biomed Mater Res, 27(9): 1135-48.
4. Lafferty RM et al. (1988) Microbial production of poly-3-hydroxybutyric acid. In: H.J. Rehm and G reed (Eds). Biotechnology: a comprehensive treatise, Special Microbial processes, VCH Verlagsgesellschaft, Weinhheim, vol6b, p135-176.
5. Pouton CW and Akhtar S (1996)Biosynthetic Polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery. Advanced Drug Delivery Review, 18: 133-162.
6. Rensch RN and Sadoff HL (1988a) Putative structure and function of a poly-β-hydroxybutyrate/calcium polyphosphate channel in bacterial plasma memebranes. Proc. Natl. Acad. Sci, 85:4176-4180.
7. Rensch RN et al., (1992) Transport of poly-β -hydroxybutyrate in human plasma. Biochim. Biophys. Acta 1123: 33-40.
8.Stuehr, D., & Nathan, C. (1989) Nitric oxide: a macrophage product responsible for cytosis and respiratory inhibition in tumor target cells. J. Exp. Med. 169, 1543-1555.
9. van der Giessen WJ, Lincoff AM et al., (1993) Marked inflammatory squelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation, Oct, 94(7):1690-7

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