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吳晨，潘繼倫，包志明，俞耀庭(南開大學(xué)分子生物學(xué)研究所生物活性材料教育部重點實驗室, 天津300071)Studies on porous chitosan microcarriersWU Chen, PAN Ji-lun, BAO Zhi-ming, YU Yao-ting(The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China)
Abstract：Using chitosan as raw materials, a suitable size (300~500µm)microcarriers were prepared by suspension method, using glutaraldehyde as crosslinker, which have an average pore size of 50~70µm, density of 1.04g/ml and porosity above 86%. The microcarriers were then modified with lactose and the reacted lactose can reached to 42.6mg/g microcarriers. Rat hepatocytes were cultured on modified chitosan porous microcarriers and retained spherical shape which was similar to those in vivo and formed aggregates on the microcarriers. In conclusion, modified porous chitosan microcarriers have a promising future in the study of the hybrid bioartificial liver support system.Key words：chitosan；microcarriers；hepatocyte摘要：利用液體石蠟作分散介質(zhì)，戊二醛作交聯(lián)劑，制備出粒徑為300～500µm，孔徑50～70µm，孔隙率86％的大孔殼聚糖微載體，并以乳糖對微載體進行了糖基化修飾，在優(yōu)化條件下其接糖量可達到42.6mg/g載體。用原代大鼠肝細胞進行材料的細胞相容性研究，結(jié)果顯示乳糖修飾的殼聚糖大孔微載體具有良好的細胞相容性。關(guān)鍵詞：殼聚糖；微載體；肝細胞中圖分類號：O636.1；R967.4 文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1001-9731（2004）增刊-2451-031 引言 人工肝支持系統(tǒng)（bioartificial liver support system，BAL）是近年來發(fā)展起來為肝衰竭患者提供體外肝功能支持的裝置，其核心部分細胞反應(yīng)器由載體材料和肝細胞兩部分組成，前者為細胞提供生長、代謝場所，后者為BAL提供特異性代謝功能。人工肝支持系統(tǒng)內(nèi)肝細胞的數(shù)量和功能是能否有效替代已衰竭肝臟功能的關(guān)鍵[1,2]。大孔微載體高的比表面積與高的孔隙率適合于在有限的培養(yǎng)體積內(nèi)黏附培養(yǎng)大量的肝細胞。殼聚糖與細胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖的分子結(jié)構(gòu)相似，殼聚糖作為材料制成微載體，其細胞親和性好，是一種制造細胞培養(yǎng)用微載體的良好材料[3,4]。本文用反相懸浮法和相分離法相結(jié)合，制備了微米級大孔殼聚糖微載體，提高了材料的孔隙率和比表面積，并以肝細胞表面無唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特異性配體作糖基化修飾以利于細胞在材料表面的粘附。通過在微載體上培養(yǎng)大鼠原代肝細胞，證明乳糖修飾的大孔殼聚糖微載體是較理想的肝組織工程支架材料。2 材料和方法2.1 材料 殼聚糖，脫乙酰度90%，分子量120萬，浙江省海洋生物化學(xué)有限公司；乳糖，A.R.，天津市化學(xué)試劑六廠；Wistar大鼠，200～250g，天津市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供；Trypan Blue，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站；膠原酶IV，Sigma Chemical Co.Ltd；HEPES，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；新生牛血清，聯(lián)星生物技術(shù)有限公司；慶大霉素，天津金耀氨基酸有限公司2.2 大孔殼聚糖微載體的制備 取一定量液體石蠟、四氯化碳和適量span80，混合均勻后加入到三口瓶中，然后按一定油水比例加入適量2.5%殼聚糖乙酸溶液，以適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣仍?5℃下充分?jǐn)嚢柚翚ぞ厶侨苣z均勻分散成合適大小液滴后，加入一定體積8%戊二醛溶液，攪拌30min后逐漸升溫至40℃，恒溫反應(yīng)2h，經(jīng)過過濾、充分洗滌后，再經(jīng)過-30℃冷凍干燥，得到殼聚糖大孔微載體。 將得到的殼聚糖大孔微載體加到濃度為30mol/dm3的乙酸鈉溶液中，按照硼氫化鈉對初始氨基總和的摩爾比率為3：1加入硼氫化鈉，室溫反應(yīng)12h，用蒸餾水洗至中性。2.3 大孔殼聚糖微載體的糖基化修飾 取1g吸干的微載體，加入2mL一定濃度的NaOH溶液，混勻后，加入適量環(huán)氧氯丙烷，于一定溫度下?lián)u床上振蕩反應(yīng)。反應(yīng)完成后裝柱，用蒸餾水淋洗微載體，洗出液用含有酚酞指示劑的1.3 mol/dm3的硫代硫酸鈉溶液檢測，至洗出液不變紅，證明剩余環(huán)氧氯丙烷已洗凈。取1g抽干的微載體加入到4mL不同pH值的乳糖反應(yīng)體系（糖初始濃度均為35mg/mL）中，在一定溫度下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取出微載體，用蒸餾水洗至中性。2.4 大孔殼聚糖微載體孔隙率的測定[5] 孔隙率的測定使用Shen F等提出的方法。通過冷干前后支架重量的變化推算出孔隙率的大小。2.5 糖基化反應(yīng)程度的測定[6] 用3,5－二硝基水楊酸比色法（DNS法）測定反應(yīng)前后乳糖濃度的變化，根據(jù)乳糖的消耗量計算出殼聚糖支架氨基的修飾程度。2.6 原代大鼠肝細胞的分離和培養(yǎng) 采用Seglen兩步灌流法[7~11]，從重量為200～250ｇ的Wistar大鼠獲得原代肝細胞。先用預(yù)灌流液(83mg/mLNaCl，0.5mg/mL KCl，24mg/mL，HEPES，pH=7.4)灌流8min，然后用含0.05%膠原酶的灌流液(預(yù)灌流液中加入5mmol/LCaCl2, 0.05%膠原酶)繼續(xù)灌流10min。將肝葉剪下，用剪刀將消化好的肝細胞輕輕刮下，獲得的肝細胞懸液400r/min離心3次，每次2min，然后重新懸浮于WE培養(yǎng)基中(含10%血清，0.2u/mL Insulin，0.292mg/mL Glutamine)。利用苔盼藍拒染法檢測細胞存活率。將分離所得的肝細胞按1×106細胞/mL的密度接3 結(jié)果和討論3.1 糖基化條件的優(yōu)化 由圖1可以看出，環(huán)氧化后的微載體在偏酸性或偏堿性的條件下均可以達到接糖量較大的目的，原因在于環(huán)氧基團在酸、堿條件下均可以開環(huán)反應(yīng)，但相比而言，偏酸性條件下的接糖量較高，原因是羥基是較弱的親核試劑，當(dāng)環(huán)氧氯丙烷在酸性條件下才能開環(huán)和羥基反應(yīng)。當(dāng)pH=4.5時接糖量大，因此乳糖的最佳接糖條件為pH=4.5。
從圖2可以看出，當(dāng)反應(yīng)達到12h時接糖量幾乎達到最大值，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，其接糖量變化不是很明顯，因此我們選擇乳糖的反應(yīng)時間為12h。其最大接糖量為42.6mg/g微載體。
3.2 紅外光譜分析 圖3中的CS-1中1599cm-1處的峰為殼聚糖上氨基的特征峰，在交聯(lián)殼聚糖的譜圖CS-2中氨基特征峰變?nèi)酰@是因為和戊二醛反應(yīng)的結(jié)果，并且在1633.3cm-1和1496.4cm-1處出現(xiàn)C=N伸縮振動特征峰，說明殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)有希夫堿的形成，CS-3中這兩個特征峰的消失說明已將希夫堿充分還原，CS-4中在810cm-1和880cm-1 處有環(huán)氧基團吸收峰出現(xiàn)，說明已經(jīng)發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)。
3.3 電鏡觀察 從圖4看到用2.5%的殼聚糖溶液制得的大孔微載體粒徑為300～500µm，孔徑40～70µm，粒徑分布較均勻，形態(tài)規(guī)整，經(jīng)測定其孔隙率為86%。 圖5是乳糖修飾后微載體上細胞培養(yǎng)的情況，由圖可見，乳糖修飾后的微載體上肝細胞密度高，肝細胞形成聚集體，保持良好的球形，表面有很多微絨毛結(jié)構(gòu)，表明肝細胞處于良好的生理狀態(tài)。聚集體內(nèi)部細胞緊密接觸，形成類組織結(jié)構(gòu)。
4 結(jié)論 用反相懸浮法結(jié)合相分離法制備了微米級大孔殼聚糖微載體，并用乳糖進行修飾，確定了反應(yīng)pH和反應(yīng)時間的最佳條件，其接糖量達到42.6mg/g載體。修飾微載體用于原代大鼠肝細胞培養(yǎng)，實驗結(jié)果表明，乳糖修飾殼聚糖大孔微載體具有良好的細胞相容性。參考文獻：[1] Hayes, Peter C, Lee Alistair. [J]. The Lancet, 2001, 358 (9290): 1286-1287[2] Kaneko M, Fukuda J, Ijima H, et al. [J]. Materials Science and Engineering: C, 1998, 6(4): 245-248.[3] Hirano S. [J]. Polym Mater Sci Eng,1990, 63:699.[4] Yagi K, Michibayashi N, Kurikawa N, et al. [J]. Biol, Pharm, Bull, 1997,20(12):1290-1294.[5] Shen F, Cui Y L, Yang L F, et al. [J]. Polym Int, 2000, 49: 1596-1599.[6] Ruliang Li. Biochemistry Experiments. [M]. Wuhan: Wuhan Univer- sity Press, 1998, 9-11.[7] Seglen P O. [J]. Exp Cell Res, 1972; 74: 450-454.[8] Seglen P O. [J]. Methods Cell Biol, 1976; 13: 29-83.[9] Helmut Segner. [J]. Comp Bioc and Phy Part A, 1998, 120: 71-81.[10] Puviani A C, Ottolenghi C, Tassinari B. et al. [J]. Comp Bioc and Phy Part A, 1998, 120: 99-109.[11] Carol J, Maslansky, Gary M Williams. [J]. In Vitro, 1982, 18(8): 683-692.基金項目：天津市自然科學(xué)基金資助項目（033608011）作者簡介：吳晨（1979－），女，天津人，碩士研究生，主要研究生物工程，生物醫(yī)用材料論文來源：中國功能材料及其應(yīng)用學(xué)術(shù)會議,2004年,9月12-16日 |
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