本發明公開了一種超分子結構水凝膠基因載體材料及其制備方法和應用。該方法包括以下操作步驟：通過對聚賴氨酸修飾聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物端基的修飾，合成出含有陽離子鏈段的多嵌段聚合物，然后將此聚合物與DNA溶液混合，得到DNA復合物膠束；進一步將此膠束溶液與α-環糊精溶液混合后攪拌，室溫下靜置，得到水凝膠。該水凝膠可用于制備可注射基因載體。本發明具有操作簡單、凝膠強度和凝膠化時間可調、室溫成型、不涉及化學交聯反應以及有機溶劑的使用、獲得的凝膠具備溫度敏感性、良好的生物相容性和明顯的轉染效果等優勢，有望在生物醫學工程材料領域得到廣泛的應用。